**RIN-14B大鼠胰岛素瘤细胞培养指南**

一、细胞培养条件

细胞名称： RIN-14B大鼠胰岛素瘤细胞

生长特性： 贴壁生长

冻存条件： 无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系： 1640培养基 + 10% 胎牛血清 (FBS) + 1% 双抗

传代方法： 第一次建议1:2进行传代

传代情况： 每2天更换培养液

备注： 用无菌离心管收集瓶中的培养基，以进行对比培养；若对比效果不佳，建议直接采购我们的完全培养基。

二、细胞收货后处理

收到细胞后，培养至良好状态后，用完全培养液灌满细胞瓶并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。使用75%酒精对细胞瓶进行消毒后，置于超净台内严格进行无菌操作，并将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。利用显微镜观察细胞生长情况，并对不同倍数的细胞进行拍照保存（建议最佳拍摄倍数为40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片默认收到的状态良好。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，则将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并放入37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，可进行以下传代步骤：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加1-2ml消化液（0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA），在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速加5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，使用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，随后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），充分混匀后装入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱；如后期需转入液氮罐，应在-80℃冰箱中存放24小时后再转入液氮罐中。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），迅速置于37℃水浴中解冻，直至无结晶后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min。
3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬并接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2培养箱中培养。
4. 第二天更换新鲜的完全培养基，继续培养。

四、注意事项

某些细胞可能在运输过程中易于脱落，属正常现象。可按以下方法处理：将所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5min，收集上清以备比较需要，沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打并消化1-2分钟，再加5ml完全培养基终止反应。之后再次离心、弃上清，加1-2ml完全培养基重悬，并按1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，然后放入37℃、5% CO2细胞培养箱培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题的重发情况

如细胞在运输途中遇到问题（如丢失、瓶身损坏、培养液严重泄漏等），可进行重发。若收到细胞48小时内出现污染问题，请提供真实的实验结果以便核实，确认后可重发。对于常温发货或干冰发货的细胞复苏后存活率低的情况，需提供真实且清晰的细胞状态照片进行跟进。对于细胞活性问题，请在收到后7天内反馈真实的实验结果，并用台盼蓝染色法对细胞活力进行鉴定。

2）不予重发的情况

若客户因操作不当造成细胞污染、状态不佳，或使用非本库推荐的培养体系导致细胞情况不良，我们将不予重发。请注意信息是否在收到细胞后的2天内反馈，逾期将不予重发。具体情况将根据每个案例综合确定。

感谢您使用ag尊龙凯时提供的细胞培养产品，期待为您提供更多优质服务！